泛亚电竞类器官原代培养流程

一、准备工作

1. 仪器设备：CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪和眼科镊。

2. 试剂耗材（以肠癌为例）：动物脑类器官培养基试剂盒（abs90050）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、60mm细胞培养皿（abs7005）、100μm滤筛（abs7009）、15mL离心管（abs7102）、15mLEP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒、眼科剪刀和眼科镊。

组分名称规格：动物脑类器官培养基A（100mL）、类器官原代培养缓冲液B（250mL）、原代组织消化液C（30mL）、类器官传代消化液D（30mL）、组织保存液E（100mL）、类器官冻存液F（20mL）、类器官传代培养缓冲液G（250mL）。

二、操作流程

1. 样本准备：

（1）将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液E的取样瓶中，确保整个组织被浸没，并在4℃下从医院或实验室取回；

（2）对取样瓶进行消毒，取出组织并放入培养皿中，用于拍照并登记样本的大小、颜色、软硬程度及组织类型等信息。

2. 清洗与剪碎：

（1）在60mm细胞培养皿（abs7005）中使用2-3mL原代培养缓冲液B进行浸泡，清洗三次（每次更换培养皿后），然后剪碎为大约1-3mm³的组织块，转移至15mL离心管中。

3. 消化与过滤：

（1）在15mL离心管中加入5倍体积的原代组织消化液C，置于37℃进行15-30分钟的消化，并随时观察情况；

（2）取少量液体在显微镜下观察，若观察到有较多的细胞团（5-50个细胞抱团）后，加入3倍体积的原代培养缓冲液B，终止消化；

（3）使用100μm滤筛（abs7009）进行过滤，取少量滤液在显微镜下观察，随后将滤液收集到15mL离心管中，于300g、4℃下富集离心5分钟，移去上清。

4. 加胶、点板及加液：

（1）准备工作：基质胶需放在金属冰盒中于4℃冰箱过夜融化；

（2）接种要求：在24孔板（abs7035）中，每孔注入25μL基质胶细胞团混合物和500-750μL类器官培养液；

（3）接种密度建议1：基质胶体积与细胞团沉淀体积按25:1配比，或者500个细胞团/25μL基质胶；

（4）加胶与点板：向细胞团沉淀中加入基质胶（abs9495），轻柔混匀后进行点板，整个操作应控制在半分钟内，利于保持基质胶的流畅性；

（5）加液：将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60分钟成胶，添加500-750μL类器官培养基A进行培养，通常可在10-14天后进行传代操作。

三、传代操作

1. 类器官收集及洗涤：

（1）用移液器吸去培养基，加入4℃的类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集于15mL离心管中；

（2）加缓冲液至定容14mL，并在4℃静置40分钟或-20℃冷冻5分钟；

（3）进行离心，以分层判断状态，通常需弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀。

四、冻存及复苏流程

使用冻存液（类器官冻存液F），轻柔重悬后立即进行冻存，搭配梯度冻存或手动冻存方法，确保类器官活性最佳。

在实验准备、取出冻存管的步骤中要确保环境无菌，并快速解冻以尽量减少损伤。在复苏之后，移动与加胶（abs9495）的步骤应严格按照程序进行，使类器官恢复到良好的生长状态。

如有疑问，欢迎与泛亚电竞的专家进行交流和探讨。